Pilsen wurde wahrscheinlich im Jahre 1295 von König Václav II. als Nová Plzeň (Neu Pilsen) gegründet. Die schon in der Vorzeit besiedelte Stadt Starý Plzenec (Alt Pilsen) verlor nach der Gründung von Plzeň ihre Stellung. Plzeň, an drei Flüssen und zwei wichtigen Handelswegen gelegen, sollte eine wichtige Rolle in Böhmen übernehmen und wurde daher sehr großzügig geplant und gebaut. Der Marktplatz ist einer der größten in Europa. Plzeň entwickelte sich schnell, sowohl wirtschaftlich wie auch politisch. In Plzeň teilten sich die Wege von Prag nach Nürnberg, nach Regensburg und Eger (Cheb) mit Anschluss an norddeutsche Städte. Kaiser Karl IV. erbaute zur Sicherung dieser Wege eine Burg, Karlskrone, welche später nach ihrem Standort auf dem Hügel Radyně benannt wurde.
In Plzeň wurden zwei Klöster gegründet: das Minoritenkloster, mit der dazugehörigen Kirche Nanebevzetí Panny Marie (Maria Himmelfahrts Kirche) im Jahr 1297, und das Dominikanerkloster mit der Kirche Sv. Ducha (Heilig Geist Kirche) nach 1300. Diese zwei Kirchen gehörten zu den ältesten Bauwerken in Plzeň - die Heilig Geist Kirche wurde jedoch 1802 abgerissen. 1320 wurde ein Spital gegründet. Die Stadt war so bedeutend, dass Plzeň in der Majestas Carolina des Kaisers Karl IV. zu den Städten gehörte, die nicht verpfändet werden dürften. Im 14. Jahrhundert entstand die Stadtbefestigung mit zahlreichen Bastionen und einem Wassergraben.
Plzeň war anfänglich der Reformbewegung zugeneigt. Hier wirkte der Priester Václav Koranda, der dem radikalen Flügel angehörte. Schon im Jahr 1414 wurden die Geistlichen der Deutschen Ritter aus der Stadt vertrieben. Die Priester in Tábor sagten das Ende der Welt für den Februar 1420 voraus. Dabei sollten jedoch nach der chiliastischen Lehre fünf Städte verschont bleiben, darunter auch Plzeň als „Sonnenstadt“. Mit Koranda, und seiner Gefolgschaft wurde Plzeň zum Zentrum der hussitischen Bewegung. Im Frühjahr zogen alle Hussiten nach Tábor. Plzeň wechselte sofort die Seiten und wurde katholisch. Václav Koranda gehörte auch in Tábor zur radikalen Gruppierung. Gestorben ist Koranda wahrscheinlich 1453 als Gefangener auf einer Burg von Jiří aus Poděbrady, dem er sich nicht unterwerfen wollte.
In Plzeň wurde 1415 auf das Bestreben des Königs Wenzel IV. der Pilsener Landfryd (Landfrieden) gegründet. Im Jahr 1420 wurde der Landfryd von Sigismund von Luxemburg bestätigt und unterstützt, mit Besitztümern belohnt und mit Geld ausgestattet.
Plzeň wurde in den folgenden Kreuzzügen zum Stützpunkt der Hussitengegner und zur Bastion des Katholizismus. Die Hussiten versuchten fünfmal die Stadt einzunehmen, zuletzt Juli 1433 bis Mai 1434, womit sie sich eine bessere Position beim Konzil in Basel verschaffen wollten. Plzeň hat sich nicht ergeben. Der abtrünnige Přibík aus Klenová belieferte die Pilsener mit Korn und rettete sie so vor dem Verhungern. Jan Čapek aus Sán, der mit seiner Truppe im Baltikum kämpfte und als Geschenk des Königs ein Kamel mitbrachte, beteiligte sich bei der Belagerung. Bei einem Befreiungsversuch wurde das Kamel erbeutet und ziert heute noch symbolisch das Stadtwappen. Im Dreißigjährigen Krieg litt die Stadt sowohl unter den hier stationierten kaiserlichen Truppen, wie auch unter den Schweden. Am Ende war die Stadt verwüstet und die Wirtschaft ruiniert. Es dauerte fast ein Jahrhundert, bis sich Plzeň erholt hatte. Durch den Bau der Škoda-Werke, der bekannten Brauerei und den vielen Betrieben wurde es zu einer Industriemetropole in Westböhmen. Die historische Innenstadt wurde zur Denkmalzone erklärt.
Magister Jan Hus hatteerfahren, dass es in Plzeň zu Zerwürfnissen gekommen war. Er schrieb in der zweiten Hälfte des Jahres 1411 an die Pilsener: “Sehr traurig bin ich zu hören, dass ihr unter euch Zerrissen seit und nicht einig seit in der Wahrheit Gottes, dass ihr gut begonnen, nun ihr Böses tut, den Gott ärgert, eure Seele abstumpfen lässt, den Anderen schlechten Beispiel gebt und eure Ehre vereitelt für einen kleinen Gewinn in dieser Welt, achtet ihr wenig auf das ewige Leben.“ Noch bevor Jan Hus seinen Brief beendete, bekam er einen Brief aus Plzeň: „Nachdem ich mein Blatt geschrieben habe, kam mir ein Blatt, in dem geschrieben steht, dass die Priester am hindern sind, das Lesen der Schrift mit der natürlichen Sprache tschechisch oder deutsch zu lesen“.
